[생물학 실험] DNA의 분리 실험

May 02, 2014

[생물학 실험] DNA의 분리 실험

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설명 : DNA 절편을 클로닝하기 위한 방법들의 공통된 특징 중 하나는 박테리아와 플리스미드를 이용하는 것이다. 박테리아 플라스미드는 비교적 작고, 염색체로부터 분리된 상태로 복제하는 원형의 DNA라는 것을 설명하였다. 플라스미드는 몇 개의 우전자만 가지고 있고 특정조건에서 박테리아를 배양할 때 유용하게 사용된다. 실험실에서 유전자나 DNA 절편을 클로닝하기 위해서는, 먼저 플라스미드를 박테리아에서 분리한 후 외분의 DNA를 플라스미드에 집어넣는다.

3.Method
1. colony 1개를 Antibiotics(예 - Ampicillin)가 포함된 liquid LB 5ml에 접종하고
37도℃ shaking incubator에서 12~16시간(O/N) 키운다.
2. Bacteria가 자란 LB중 1ml을 E-tube로 옮긴다.
3. 12,000rpm 30초(또는 3,000rpm 15분)간 원심분리하고 상층액을 완전히 버린다.
4. Resuspension buffer를 250㎕넣고 vortexing을 하여 pellet을 완전히 풀어준다.
5. Lysis buffer를 250㎕넣고 5~6회 inverting해준다.
(주의-gently inverting하고 lysis 시간은 5분을 넘어서는 안된다.)
6. Neutralization buffer를 350㎕넣고 9~10회 inverting해준다.
7. 12,000rpm에서 10분간 원심분리한다.
(기다리는 동안 column을 collection tube에 꽂는다)
8. 상층액을 column에 옮긴다. (주의-pellet이 딸려오지 않게 한다)
9. 12,000rpm에서 1분간 원심분리하고 collection tube에 있는 용액을 버린다.
10. Washing bufferA 700㎕를 넣고 1분 원심분리하고 collection tube의 용액을 버린다.
11. Washing bufferB 700㎕를 넣고 1분 원심분리하고 collection tube의 용액을 버린다.
11. 빈 collection tube에 column을 끼우고 12,000rpm에서 1분 동안 원심분리한다.
12. column을 E-tube에 옮기고 50㎕의 elution buffer를 넣은 후 1분간 incubation한다.
13. 12,000rpm에서 1분간 원심분리한다.
4.Discussion
이번 실험에 사용된 mini-prep이라고 부르는 방법은 plasmid DNA를 소량 분리하는 방법이다. 가장 보편적으로 사용되는 방법인 Alkali lysis method이다.